Biomarcadores baseados na exposição a micotoxinas nas avaliações de campo

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Atualmente, há um interesse muito grande em biomarcadores de micotoxinas, com base no crescente número de produtores que perguntam sobre esse tema. O termo “biomarcador de micotoxina”, neste contexto, está associado aos indicadores de exposição (micotoxinas e respetivos metabólitos nos fluidos corporais, fezes ou órgãos). Este tipo de biomarcador é visto pelos investigadores como uma ferramenta para medir a exposição alimentar dos humanos e animais às micotoxinas. Por outro lado, a indústria tem uma perspectiva diferente sobre o assunto; considera-o um teste mais barato, rápido e confiável para medir a eficácia de um aditivo antimicotoxinas em comparação com os tradicionais parâmetros de avaliação, como por exemplo, desempenho.

Posto isto, este artigo irá resumir as informações sobre os biomarcadores para as micotoxinas mais importantes nas diferentes espécies animais. Irá também salientar pontos de criticos de avaliação da eficácia dos agentes sequestrantes de micotoxinas à campo , medindo biomarcadores diretos em diferentes substratos fisiológicos.

Tipos de biomarcadores

Muitos autores definem dois tipos de biomarcadores: diretos e indiretos. Os biomarcadores diretos ou de exposição são específicos, enquanto os biomarcadores indiretos ou de efeito são geralmente não específicos e representam alterações estruturais ou funcionais produzidas no corpo sob exposição a determinados fármacos ou toxinas. No entanto, em alguns casos, estas alterações podem servir como biomarcadores de exposição quando ambos os processos estão diretamente ligados (Groopman and Kensler, 1999; Perera and Weinstein, 2000; Silins and Högberg, 2011). Porém, as sugestões seriam utilizar três subtipos de biomarcadores de micotoxinas (figura 1): biomarcadores baseados na exposição (diretos), mecanismo (indiretos) e efeito (indiretos).

Os biomarcadores de exposição caracterizam-se pela presença de micotoxinas ou seus respectivos metabólitos (por ex., conjugados de glutationa ou glicuronideo). Estes compostos podem ser detectados em tecidos ou fluidos biológicos (Baldwin et al., 2011). Em contrapartida, os biomarcadores relacionados com o mecanismo avaliam alterações específicas das micotoxinas em determinadas proteínas, metabólitos celulares ou expressão genica. Os biomarcadores de efeito expressam o efeito da micotoxina no desempenho e outros parâmetros de saúde, como a integridade intestinal, o título de anticorpos, lesões típicas, o nível de enzimas hepáticas no soro ou mesmo o ganho de peso e a conversão alimentar. No entanto, são menos específicos para micotoxinas quando comparados com biomarcadores relacionados com o mecanismo e menos ainda quando comparados com biomarcadores de exposição.

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Figura 1. Sugestão de classificação dos biomarcadores de micotoxinas

Substratos fisiológicos de biomarcadores

Os biomarcadores específicos (de exposição e relacionados com o mecanismo) são medidos em fluidos corporais ou tecidos, como a própria molécula, um metabólito ou um produto de uma reação com uma molécula biológica. Os parâmetros mais comuns na quantificação da exposição a micotoxinas são medidos na urina, no soro e no leite. No entanto, existem outras matrizes biológicas, como as fezes e os pelos, que podem fornecer informações importantes.

Sangue. Muitas micotoxinas (aflatoxinas, ocratoxina A, desoxinivalenol (DON), zearalenona) são rapidamente absorvidas na parte superior do intestino, resultando num pico acentuado no sangue nas 2 horas após a ingestão oral (figura 2) na maior parte das espécies animais. Por outro lado, as fumonisinas têm uma disponibilidade limitada e os seus níveis no sangue são insignificantes. Como consequência, os biomarcadores de exposição de micotoxinas com elevada biodisponibilidade só podem ser detectados no soro e plasma em elevadas concentrações logo após a ingestão oral. Estes também são rapidamente eliminados da corrente sanguínea. Isto é fundamental, uma vez que o tempo de coleta do sangue é essencial durante estudos in vivo de biomarcadores. Os biomarcadores relacionados com o mecanismo, como adutos proteicos, possuem meia vida mais longa no sangue. Dentre todos os biomarcadores, estes fornecem a maior parte das informações dos efeitos cumulativos, apesar de poderem ser menos específicos para  uma micotoxina.

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Figura 2. Perfil da concentração de plasma de DON após a administração oral em leitões (investigação da Nutriad com base no método de Devreese et al., 2012)

Bíle: a veia porta transporta sangue com micotoxinas absorvidas no estômago, pâncreas e intestinos para o fígado. A excreção biliar é a principal rota de eliminação de micotoxinas, independentemente das taxas de absorção serem elevadas ou baixas. De fato, em alguns casos, nos quais as micotoxinas são introduzidas em baixas concentrações, a micotoxina só pode ser detectada na bíle (Armorini et al., 2015). Uma vez que a coleta de amostra da bíle requer a eutanásia do animal, os substratos dos biomarcadores  são, infelizmente, apenas praticáveis em estudos de campo em aves.

Urina: a fração principal das micotoxinas rapidamente absorvidas passa através do fígado e circula rapidamente através do sangue antes de ser excretada como os seus metabólitos ou inalterada na urina. No entanto, a correlação entre a micotoxina ingerida e o nível de micotoxina na urina é mais baixa quando comparada com o sangue, devido a variações da quantidade de urina relacionadas com os alimentos. Vários autores recomendam utilizar creatinina como um indicador da quantidade de urina produzida (Kraft and Dürr, 2005) uma vez que a excreção de creatinina não está relacionada com os alimentos. A relação entre a concentração de toxinas e o conteúdo de creatinina de urina é recomendada para análises posteriores. Este substrato fisiológico não é uma matriz adequada para estudos de campo em aves.

Leite: os metabólitos das aflatoxinas, DON, zearalenona e ocratoxina A podem ser detetados em várias concentrações no leite de mamíferos não ruminantes. Nos ruminantes, o leite é uma matriz fácil e amplamente utilizada apenas para a estimativa da exposição às aflatoxinas. Atualmente, não existe correlação entre os níveis de toxinas no leite em comparação com o soro, sugerindo que a transferência da toxina  do sangue para o leite não é um processo ainda totalmente compreendido (Biasucci et al., 2010).

Fezes: a taxa de absorção gástrica de algumas micotoxinas (por ex., fumonisinas) é muito reduzida e uma grande parte é eliminada nas fezes. As micotoxinas com uma elevada biodisponibilidade são excretadas nas fezes a uma taxa muito reduzida (Turner et al., 2010). A quantificação de biomarcadores nas fezes como uma estimativa do sequestrante de micotoxinas tem potencial; contudo, esta abordagem tem muitas limitações, incluindo a possível metabolização de micotoxinas ligadas pela microflora no intestino grosso. Outra conclusão é que as concentrações de micotoxinas nas fezes podem diminuir com um aumento da dose de adsorvente na dieta. É também sugerido que as toxinas adsorvidas por argilas podem não ser detectáveis nas fezes quando são utilizados procedimentos analíticos de referência para outros substratos fisiológicos ou para ração (Sulzberger et al., 2017).

Órgãos: a análise dos biomarcadores de micotoxinas nos órgãos requer um procedimento invasivo, como uma biópsia ou um estudo post-mortem. A acumulação de várias micotoxinas nos tecidos acontece principalmente no fígado e nos rins. A utilização de órgãos como uma matriz biológica possui várias vantagens, como o efeito de acumulação da micotoxina e a menor  variação do horário de alimentação em relação a coleta de amostra. Algumas micotoxinas, mesmo quando introduzidas em baixas concentrações, são retidas no fígado e nos rins de uma forma não metabolizada (revisto em Voss et al., 2007) ou metabolizada. As micotoxinas persistem nos rins muito mais tempo do que no plasma ou no fígado e os níveis podem ser 10 vezes a quantidade no fígado (Martinez-Larranaga et al., 1999; Riley and Voss, 2006).

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Pelo: esta é a amostra biológica mais fácil para coleta na análise de biomarcadores. Sewram et al. (2003) mostrou pela primeira vez que as fumonisinas podem acumular-se no pelo de humanos e primatas. Infelizmente, não existem informações confiáveis sobre o acumulo de fumonisinas ou outras micotoxinas nos pelos de animais domésticos.

Diferenças específicas da espécie

Para selecionar um substrato fisiológico consistente na análise de campo dos biomarcadores, os processos de absorção, distribuição, metabolismo e excreção de cada micotoxina devem ser compreendidos. Isto permite que os biomarcadores mais apropriados para cada micotoxina sejam identificados para um grupo específico de animais.

As micotoxinas têm diversas vias metabólicas in vivo que variam enter as espécies animais. A ingestão de micotoxinas e subsequente distribuição de tecidos é controlada pela absorção gastrointestinal que é diferente para cada micotoxina e para cada espécie animal (Grenier and Applegate, 2013). O metabolismo das micotoxinas em todos os animais ocorre tanto no aparelho digestivo como nos tecidos e órgãos extraintestinais. A organização do sistema digestivo (ausência ou presença de pré-estômagos) e o diferente metabolismo celular do epitélio ou da microbiota intestinal específica por espécie, pode influenciar significativamente a formação de biomarcadores de diferentes tipos. O destino de uma micotoxina no corpo, mais especificamente, a sua possível transformação nos pré-estômagos antes da absorção, ou a sua taxa/velocidade de absorção, é importante para escolher o substrato mais representativo (biomarcador) em cada espécie animal.

Aves: devido a rápida absorção nas aves, os níveis séricos de biomarcadores sanguíneos de exposição para aflatoxinas e ocratoxina A mostrarão um pico acentuado de 1 a 2 horas após a ingestão da ração contaminada. Por este motivo, o estudo de biomarcadores diretos na matriz sanguínea é muito sensível à hora  da coleta de sangue. A análise de marcadores de exposição de DON, fumonisinas e toxinas T-2 em sangue de aves possui um baixo valor prático na avaliação de campo devido aos baixos níveis de absorção destas micotoxinas. Além disso, a coleta de amostras de sangue pode resultar na morte repentina das aves. Portanto, este método só é recomendado para estudos post mortem nesta espécie. Existe uma elevada excreção biliar tanto de micotoxinas de elevada como de baixa absorção (Cavret and Lecoeur, 2006) assim,  a bile pode ser um substrato confiável para biomarcadores de exposição para a maior parte das micotoxinas em aves. Como conclusão, a matriz mais adequada para a avaliação de campo de biomarcadores de exposição em aves está limitada à bile, fezes e possivelmente aos rins. Para as fumonisinas, devido à sua reduzida biodisponibilidade, a análise dos biomarcadores de exposição no sangue não é adequada, e os biomarcadores relacionados com o mecanismo podem ser a única opção. A única matriz não invasiva para  biomarcadores baseados em  exposição e  mecanismo em aves são as fezes. Em geral, a utilização de alguns biomarcadores de efeito é mais fácil para estudos de campo com aves através do estudo post mortem dos órgãos e sangue.

Suínos: o custo mais elevado de um suíno, em comparação com uma ave, requer métodos de coleta de amostras pouco ou não invasivos durante a avaliação de campo de biomarcadores de micotoxinas. A absorção rápida de DON, aflatoxinas e ocratoxina A em suínos torna o estudo de campo de biomarcadores de exposição no sangue muito dependente da hora da coleta da amostra, uma vez que o seu pico no sangue ocorre entre os 15-30 min após a ingestão (Prelusky et al., 1988). Para micotoxinas rapidamente absorvidas, a urina pode ser uma matriz mais confiável para biomarcadores de exposição e de mecanismo em suínos. A avaliação relativamente confiável e fácil dos marcadores de efeito estão disponíveios em suínos para elevados níveis de zearalenona e DON (por ex., desempenho reprodutivo e consumo de ração).

Ruminantes: nos ruminantes, a única forma de avaliar os biomarcadores de micotoxinas no campo é a utilização de métodos de coleta de amostras pouco ou não invasivos. O leite é o substrato preferido dos no monitoramento de biomarcadores para aflatoxina M1 (exposição). Esta é uma prática comum especialmente em países com um risco mais elevado de aflatoxinas na ração ruminantes. No entanto, esta matriz é menos adequada para a deteção de biomarcadores de exposição de outras micotoxinas, devido à transferência significativamente menor dos alimentos para animais para os géneros alimentícios. É possível detetar DON, ocratoxina A, zearalenona ou seus respectivos metabólitos no sangue de ruminantes; contudo, a urina é a matriz não invasiva preferida.

Avaliação de campo versus científica

A razão mais comum da quantificação de biomarcadores de micotoxinas diretos em estudos científicos é a estimativa da exposição alimentar às micotoxinas. Na indústria animal, além da avaliação da exposição, a estimativa da potencial eliminação dos efeitos de micotoxinas nos animais é também de extrema importância.

Os agentes sequestrantes de micotoxinas (nomes alternativos: inativador, detoxificador, adsorventes) são aditivos alimentares que visam reduzir a toxicidade de micotoxinas através da ligação da toxina (adsorventes de micotoxinas), alterando a estrutura química da micotoxina no trato gastrointestinal para metabólitos não tóxicos (agentes transformadores de micotoxinas) ou diminuindo os efeitos secundários negativos da exposição de micotoxinas a animais (inativadores de micotoxinas). Enquanto os produtores parecem entusiasmados com a utilização de biomarcadores de exposição como uma ferramenta prática para verificar o desempenho dos sequestrantes de micotoxinas, é essencial considerar as várias limitações importantes:

  • biodisponibilidade de micotoxinas: algumas das micotoxinas, como as fumonisinas, são pouco absorvidas, e dificilmente podem ser detectadas no sangue ou na urina. Outras, como o DON, têm uma cinética específica por espécie e são bem absorvidas nos suínos, mas pouco absorvidas nas aves e ruminantes adultos. Portanto, a escolha de um substrato fisiológico é específica de cada micotoxina e de cada espécie animal.
  • cinética de micotoxinas absorvidas: a maior parte das micotoxinas atingem o pico no sangue entre 1 a 2 horas após a ingestão. A escolha do sangue como o substrato de biomarcador de exposição para o campo de teste requer um horário de alimentação e de coleta de sangue muito controlado. Além disso, as micotoxinas principais podem ser rapidamente metabolizadas no fígado noutro composto tóxico ou não tóxico. Como consequência, é importante detectar vários metabólitos de micotoxinas que também podem ser específicos por espécie.
  • efeito biológico de cada micotoxina: por exemplo, os principais efeitos negativos das fumonisinas e dos tricotecenos estão relacionados com o efeito adverso no trato gastrointestinal. A utilização de determinados adsorventes pode resultar numa redução dos níveis de DON no sangue e na urina e isto levar a uma conclusão errada pelo no efeito do aditivo. De acordo com alguns investigadores, esses adsorventes podem dar origem a níveis mais elevados de DON nas partes distais do intestino, o que pode afetar negativamente a integridade do mesmo (Osselaere et al., 2013). Isto pode aumentar a incidência e gravidade dos surtos bacterianos e de coccidias.
  • é importante ter em consideração as grandes variações individuais entre animais quando medir os níveis de biomarcadores.
  • procedimento analítico: o sangue, a urina, as fezes e os órgãos são matrizes muito complexas e apenas alguns laboratórios no mundo possuem métodos validados para a avaliação quantitativa dos biomarcadores de exposição de interesse. É especialmente mais um problema para os metabólitos, uma vez que estes necessitam de padrões muito específicos, caros e dificilmente disponíveis.
  • o principal modo de ação do produto: a análise dos níveis de micotoxinas e respetivos metabólitos nos tecidos e fluidos corporais podem representar apenas o modo de ação de adsorção do produto ou a sua ação de biotransformação. A medição que os biomarcadores de exposição não podem demonstrar o efeito dos inativadores de micotoxinas com outros modos de ação em relação às micotoxinas ou respetivas consequências negativas. O exemplo mais representativo diz respeito às fumonisinas, onde o modo de ação que não o de ligação é responsável pelos efeitos positivos de inativadores mais complexos no controle dos níveis de Sa/So.
  • Um grupo de controle é necessário para retirar a conclusão correta sobre a capacidade de ligação do produto in vivo.

Resumo

Pode parecer mais fácil avaliar a eficácia de um produto através da medição do nível de micotoxinas ou o seu metabólito em fluidos fisiológicos do que confiar nos dados do desempenho animal obtidos a longo prazo. Contudo, esta abordagem depende muito de vários fatores, incluindo a toxina específica a ser medida, a disponibilidade de determinados tecidos ou líquidos, o propósito específico do estudo e o modo de ação do produto. O método analítico disponível é certamente um problema, sendo importantes fatores como a especificidade, a sensibilidade, o custo e o rendimento. A maior parte dos métodos para biomarcadores específicos ainda necessita de otimização e validação (Vineis and Garte, 2008).

Portanto, não existe um método prático, com base nos biomarcadores diretos (de exposição e de mecanismo), que consiga obter conclusões precisas sobre a eficácia do sequestrante de micotoxinas que possa ser recomendado. Atualmente, a combinação de informações sobre indicadores clínicos (biomarcadores com base em efeitos indiretos), a exposição confirmada ou suspeita (análise da ração) e a pesquisa de dados in vivo do aditivo antimicotoxina é a melhor e mais económica solução para a avaliação do produto.

Referências

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